横纹肌肉瘤的诊断及治疗研究进展

http://html.rhhz.net/JLDXXBYXB/html/2017-05-1059.htm

原颖丽 , 撒焕兰 , 马克威

[摘要]: 横纹肌肉瘤（RMS）是儿童常见的软组织肿瘤。染色体异常和分子通路的改变是其产生的主要原因。由于缺乏特异性临床表现，导致诊断较困难，传统的诊断方法仍以病理诊断为主，但无法观察疗效，判断预后，检测肿瘤的复发和转移。肿瘤标志物的不断出现很好地弥补了这一缺陷。尽管对发病机制进行了深入研究，但仍无法控制疾病的进展，这就需要研究者提出更为有效的治疗方法去解决这一难题。既往治疗都是以手术、化疗和放疗相结合为主，尽管综合治疗的方法已明显提高患者的治疗效果，但是对于中高危险度的患者疗效仍不理想。分子靶向治疗和免疫治疗方法的出现，为RMS的治疗提供了新的方向。本文作者就近几年来关于RMS的诊断、分子靶向和免疫治疗进行综述。

关键词: 横纹肌肉瘤 染色体异常 肿瘤标志物 分析靶向治疗 免疫治疗

Research progress in diagnosis and treatment of rhabdomyosarcoma

横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma, RMS)是发生自胚胎间叶组织的恶性肿瘤, 占儿童实体肿瘤的15%，软组织肉瘤的50%。RMS临床表现的多样性、病理改变的多重性以及发病部位的不同，使其成为小儿肿瘤中最复杂的一种。2013版WHO软组织与骨肿瘤新分类中将RMS分为胚胎性横纹肌肉瘤(embryonal rhabdomyosarcoma, ERMS)、腺泡状横纹肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma, ARMS)、多形性横纹肌肉瘤(pleomorphic rhabdomyosarcoma，PRMS)及梭形细胞/硬化性横纹肌肉瘤(spindle cell/sclerosing rhabdomyosarcoma)。手术切除、化疗和放疗是RMS的主要治疗手段。随着化疗方案的不断改进，虽然化疗药物有明显的毒性，但可使患者无复发，生存率提高到70%~80%[1]。尽管积极治疗，转移性疾病患者的5年生存率仍然只有30%[2]。这就迫切需要找到新的诊断治疗方法，提高RMS患者的生存率。目前国内外对于RMS的诊断治疗方法的论述多限于个案报道，或者处于试验阶段, 鲜有归纳总结，本文作者将从诊断和治疗这2个方面进行全面综述，为临床提供指导。

1 RMS发生的分子机制

目前研究[3]认为：染色体异常和分子通路的改变是RMS产生的主要原因，其中由于染色体异位产生的典型的配对盒基因3-叉头状转录因子O1(paired box gene 3-forkhead box O1, PAX3-FOXO1) 和PAX7-FOXO1融合出现在约80%的ARMS中。其他融合基因也不断被发现。融合基因的存在使ARMS患者预后差，生存率低。另外，该融合基因也可以通过影响其所在信号通路上的靶点进而导致肿瘤的发生。染色体和染色体臂的扩增和缺失在融合基因阴性的RMS中非常普遍，例如在ERMS中没有融合基因的出现，多数ERMS存在11号染色体短臂区等位基因丢失，即11p15.5杂合性丢失，该杂合性丢失提示抑癌基因失活从而导致细胞增殖增加、凋亡减少[4]。虽然ERMS发生率较ARMS高，但其预后却较ARMS好。研究[5-7]显示：RAS通路的突变、Notch信号通路的激活、刺猬(hedgehog，Hh)信号通路中基因水平的增加，Yes相关蛋白1(yes-associated protein1，YAP1) 信号通路的活化和P53通路的改变，都可诱导细胞无限增殖进而发生致瘤性转化。此外，一些罕见的基因突变、扩增或抑制都是导致RMS发生的原因。

2 RMS的诊断

RMS缺乏特异性临床表现，诊断较困难，病理检查是目前RMS确诊的诊断方法，但影像学辅助检查也发挥着不可或缺的作用。肿瘤的部位、大小通过常规的B超、CT和MRI即可检测出，其他部位是否存在转移也可以通过影像学手段进行检测。对于一些恶性程度较高的肿瘤，需行骨髓穿刺检查明确肿瘤是否侵犯骨髓。文献报道[8]显示：与传统的影像学比较，PET-CT对RMS诊断的敏感度可达到67%~86%，特异度可达90%~100%。对于一些特殊的不能进行手术切除的RMS，如口咽部、脑膜旁等的RMS，局部小切口活检或带芯穿刺针穿刺是RMS主要的病理诊断方法。

目前免疫组织化学已应用于多种肿瘤的检测诊断中，其对RMS的检测诊断也有重要的作用，目前肌红蛋白(myoglobin)、肌动蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)和肌间线蛋白(desmin)等已是临床常用的标志物，有助于对RMS的鉴别诊断，但是这些标记物灵敏度和特异度较低，促使研究者继续寻找更佳的横纹肌源性生物标记物。刘丽丽等[9]发现应用免疫组织化学检测ERMS和ARMS的主要鉴别点在于前者的肌细胞生成素(myogenin)呈弥漫性细胞核的强阳性表达，ARMS为局灶性的细胞核弱表达。研究[10]显示：肌细胞生成素的过度表达能够激活小窝蛋白3(caveolin-3) 启动子的活性从而引起caveolin-3的转录。caveolin-3在有丰富胞质的发育较成熟的肿瘤细胞中阳性表达明显增强，而分化较原始的肿瘤细胞染色相对较弱或呈阴性表达[11]，其在RMS的鉴别诊断中有重要的意义，并有较好的敏感性和特异性, 与临床常用抗体desmin和生肌调节因子(myoD 1) 之间的表达差异无统计学意义，因此在临床上可以作为诊断RMS的又一免疫组织化学标记物[12]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和4E结合蛋白Ⅰ(4E binding protein，4E-BPⅠ)是mTOR信号通路2个关键蛋白，mTOR活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，同时参与血管形成，在肿瘤的形成和发展中扮演非常重要的角色，并参与肿瘤的侵袭和转移，童刚领等[13]研究发现：磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mToR)在RMS组织中的表达与肿瘤病理亚型有关，在ERMS中p-mTOR蛋白表达高于其他类型，且其阳性表达的患者3年总生存率明显差于阴性表达的患者，因而p-mTOR蛋白可以作为判断RMS患者的一个不良预后因素，是一个很好的蛋白标记物。磷酸化4E结合蛋白I(phosphorylated 4E binding protein，p-4EBPI)在肿瘤直径>5 cm组织的阳性表达率明显高于肿瘤直径≤5 cm组织的阳性表达率，因此p-4EBPI蛋白可能与RMS的转移等侵袭性有关。可见p-4EBPI蛋白也可以作为RMS患者一个很好的蛋白标记物，与p-mTOR蛋白共同预测患者的预后，并为临床治疗提供参考。管雯斌等[14]发现：ERMS波形蛋白(vimentin，VIM)、肌细胞生成素和生肌调节因子均有不同程度的阳性表达。随着这些标志物的出现，为原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、肿瘤之间的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断、肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测提供了很好的指标。

3 治疗

RMS的治疗具有特征性，随着疾病的进展，传统单一的治疗模式已无法使患者生存率得到提高。放疗、手术、化疗及中药的综合应用的出现，可以明显提高患者的治疗效果。目前联合治疗的方法已使儿童RMS的无病生存率达到约70%。尽管联合治疗疗效很好，但是对于中高危险度的患者来说却不理想，这就要求研究者寻找更佳的治疗方案。

3.1 分子靶向治疗

随着致瘤基因的不断发现，很多靶向药物已经在临床起了显著作用。有些靶向药物已经纳入了国际肿瘤学界公认的标准治疗方案和规范，为肿瘤患者带来福音。

下游转录因子的扩增会导致PAX3-FOXO1过表达从而导致ARMS的发生，如成纤维细胞生长因子受体4(fibroblast growth factor receptor4，FGFR4) 可以导致细胞过度增殖，胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor，IGF-1R)可以刺激成肌细胞的增殖，肝细胞生长因子受体(c-met)可以诱导恶性细胞发生迁移。此外，PAX-FOXO1融合蛋白还会扰乱myogenin的功能，导致RMS中成肌细胞失分化[15]。因此可以通过抑制下游转录因子的扩增来抑制RMS的形成。人染色体2q24上的MYCN基因以及人染色体12q13-15区域上的神经胶质瘤致病因子1/鼠双微染色体2/细胞周期蛋白依赖性激酶4(glioma-pathogenic-factor1/Mouse-double-chromosome2/cyclin-dependent kinase 4，GLI1/MDM2/CDK4) 基因[16]，其扩增出现在PAX融合基因阳性的ARMS中，作为融合基因下游的转录因子参与肿瘤的形成。PAX-FOXO1促成MYCN表达, MYCN与PAX-FOXO1在肿瘤发生中起协同作用, 协同加强致癌活性[17]。抑制CDK4、MDM2和MYCN基因的扩增也为抑制RMS的形成提供了靶点。研究者通过体内和体外实验[18]发现：作为IGF-R可逆性竞争性拮抗药，BMS-754807可作用于PAX-FOXO1 RMS的IGF-R进而促进肿瘤细胞的凋亡。

作为强力致癌基因的间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)基因出现在3%~5%的非小细胞肺癌中。研究者[19]在一项有189例RMS患者的临床试验中发现：ALK基因与RMS的发生存在关联。ALK在基因和蛋白水平的畸变常发生于ARMS中，在ERMS中与疾病进展和预后相关。研究者[20-21]发现：ALK可以激活信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3), 蛋白激酶B/磷脂酰肌醇3-激酶(protein kinase B/phosphatidylinositol 3-kinase，PKB/PI3K)及RAS/ERK信号通路, 这些信号通路与细胞的迁移、扩增和生存有关。Lee等[22]研究发现：ALK阳性的患者相对于ALK阴性的患者整体生存率较差，ALK过表达成为RMS预后不良的一个独立指标。在体外临床试验[23]中发现：ALK抑制剂——NVP-TAE684对体外某些RMS细胞存在抑制作用；另外还有研究者[23]发现：抑制IGF-1R的药物mAb R1507会降低ARMS细胞系中一些细胞的增长，诱导某些细胞的凋亡，而同时使用NVP-TAE684和R1507在ARMS中呈现出协同作用，但对于体内的研究还需要进行更多的实验验证。虽然ALK抑制剂联合IGF-1R抑制剂治疗RMS是一个理想的选择，但仍需要更多的临床研究去证实。

PI3K/mTOR通路激活是RMS发生的原因之一。通路的激活可以促进肿瘤细胞增殖，抑制化疗药物抗肿瘤活性。研究[24]证明：PI3K/mTOR双重抑制剂bez235与溶酶体剂CQ会诱导ERMS细胞凋亡，该结果为研究者提供了新的思路，对未来的治疗方案会产生重要影响。

现在有相当多的证据[25-27]表明：异常肝细胞生长因子受体/分散因子(receptor of hepatocyte growth factor/scatter factor, HGF/SF)信号通路在肿瘤发生发展中起重要的作用，c-Met基因的突变或过表达与许多人类肿瘤的侵袭、转移有关。目前在RMS细胞系中观察到高磷酸化c-Met的表达。在体外临床实验[28]中发现：SU11274作为met基因的小分子抑制剂，通过抑制c-Met磷酸化抑制RMS细胞的增长和侵袭。

血管内皮生长因子可以通过自分泌和旁分泌方式诱导血管的生成，促进肿瘤细胞的增殖和生长。近年来，一种名为贝伐单抗的抗血管内皮生成素单克隆抗体已成功应用于RMS移植瘤模型[29]，另一种抗血管生成素——恩度对于抗RMS血管生成的作用也在体外细胞[30]和A673裸鼠移植瘤模型[31]中得到验证，因而抑制肿瘤血管的生成也是一个很好的治疗靶点。

作为Raf-1、VEGFR1、VEGFR2和PDGFR-β等靶点的抑制剂，索拉菲尼可以通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(activated protein kinases，MAPKs)信号传导通路或阻断肿瘤新生血管的形成，从而直接或间接抑制肿瘤细胞的生长。在RMS生物学中扮演重要角色的PDGFR以及由RAS信号通路激活的Raf，都可以作为索拉非尼潜在的靶标治疗RMS[32]。

帕唑帕尼是多种血管内皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体等的多酪氨酸激酶抑制剂，这些生长因子受体在RMS的发病机制中扮演着重要的角色。作为第一种被FDA批准用于成人恶性软组织瘤的药物，尽管在RMS的异种移植瘤实验中未观察到客观反应，但与对照组相比无事件生存率明显提高[33]。

在胚胎发育的过程中Hh信号通路控制细胞的生长和分化，而信号通路抑制剂vismodegib已用于转移性和局部浸润性基底细胞癌的治疗，并且还应用于其他的Ⅰ/Ⅱ期临床试验的晚期或转移性肉瘤、软骨肉瘤[34]，这也将成为治疗RMS的一个潜在目标。

Ciccarelli等[35]在实验中发现：MAPKs信号通路与ERMS细胞系RD细胞的生存性能及抗辐射性密切相关，将该信号通路的抑制剂U0126作用于RD细胞后，会增加RD细胞对放射线的敏感性，因而可以将MAPKs信号通路抑制剂与放疗联合应用来治疗RMS，这一治疗方法完全不同于传统的治疗方法。虽然这一实验未应用于临床，但已为RMS的治疗开辟了新的方向。

放化疗是许多肿瘤常见的治疗方法，主要是通过损伤肿瘤细胞DNA达到治疗肿瘤的目的。但是这种损伤一旦恢复就会导致肿瘤细胞重新复活。基于这种观点，Kim等[36]在研究中发现：聚ADP核糖聚合酶1(poly polymerase 1，PARP1) 和磷酸化组蛋白5(gamma H2AX5，γH2AX5) 是人类软组织肿瘤独立的预后不良的指标，并且也是人类肿瘤对放化疗产生抵抗性的一个原因。因而研究者可以针对PARP1 /γH2AX通路来寻找治疗软组织肿瘤患者的方法。

虽然作用于信号通路靶点的药物很多，为RMS患者的治疗提供了新的方向，但是目前其临床疗效并不确定，不能直接应用于患者，因而需要研究者进行大量实验验证药物的剂量安全性及不良反应。

3.2 免疫治疗

生物免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗方法，主要是通过增强机体自身的免疫功能，从而消灭肿瘤细胞，目前已应用于多种实体瘤的治疗中，可以延长患者生存期、提高患者生活质量和抑制肿瘤恶化。

虽然不同的基因调控机制仍在研究中，但是表观遗传修饰，特别是DNA甲基化，可以调节基因的表达，并且在癌症的研究中是一个具有挑战性的领域。已有研究[37]表明：表观遗传信息如DNA甲基化分析，有助于识别肿瘤亚型，并可以更准确地诊断肿瘤类型。几个全基因组的研究[38]表明：DNA甲基化可以调控与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10, PTEN)，导致肿瘤的发生。作为新发现的肿瘤抑制基因——原钙黏连素4(protocadherin alpha 4，PCDHA4)，也是因DNA的甲基化抑制其功能从而导致RMS的发生[39]。应用于表观遗传学的治疗方法可以作为治疗RMS的一种方案。表达于T细胞表面和初级B细胞表面的程序性死亡受体1(programmed death receptor 1，PD1) 在细胞的分化和凋亡中发挥作用。其配体PDL1的表达在许多人类肿瘤组织中均可检测到。对于PD1/PDL1免疫检查点的封锁也有望应用于小儿肿瘤中。Aoki等[40]发现：PD-L1在小儿实体肿瘤中表达频数较低，但在预后差的类型中表达较高，因而研究者可以通过封锁PD1/PDL1免疫检查点治疗小儿实体瘤。

用病毒治疗肿瘤的方法早前就已经开始，目前应用这种方法治疗RMS依旧是研究的热点。Kinn等[41]在实验中建立裸鼠的RMS模型，当瘤体最大径长至约5 mm时注入一种由黏液瘤病毒表达的红色荧光蛋白(myxoma virus，MYXV)，72 h后观察发现瘤体明显缩小，这是第1例用溶瘤病毒治疗RMS的报道，这一案例研究结果表明可以将该蛋白用于治疗RMS患者，但其应用于人类的可行性仍需进一步研究。

肿瘤代谢不进行三羧酸循环，而是直接将葡萄糖转变成乳酸，即使在氧气充足的情况下也是如此。因而肿瘤细胞不仅可以快速增殖，也可以通过氧化物的生成诱导DNA损伤，加速基因突变率。各种细胞周期调控因子，致癌相关信号通路都可以参与细胞代谢调控。尽管细胞代谢有关内容在RMS的研究中较少[42]，但其有望成为治疗RMS的一种方法。肿瘤细胞较高的代谢水平导致其活性氧自由基水平较高，因而研究者可以通过阻止肿瘤细胞的氧化应激进而治疗肿瘤[43]。

4 结语

随着对RMS深入研究，使得研究者对RMS发生、发展有了更加深刻的理解，为RMS的早期诊断提供了理论依据和实验基础，为其治疗提供了广阔的思路和新的方向。各种治疗的联合应用使患者的治愈率明显提高，新的诊断治疗方法不断出现，给高危患者带来了新的希望。